甲基化酶法转化新技术,可直接测序5mC,有望应用于疾病早筛!-技术前沿-资讯-生物在线

甲基化酶法转化新技术,可直接测序5mC,有望应用于疾病早筛!

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2024-01-26T00:00 (访问量:42601)

 

DNA甲基化(5mC)可在肿瘤发生的早期被检测到,具有较好的稳定性,是肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。DNA甲基化检测首先要进行甲基转化,常见的分析方法是使用化学品或酶,以不同的方式与甲基化修饰的C及未修饰的C发生反应,从而将两者区分开。目前有两种策略,一种是通过将非甲基化的C转化为U,如重亚硫酸氢盐转化法(BS-Seq)、EM-seq等;另一种是将甲基化的C转化为U,如TAPS等。

 

表1. 转化技术对比

技术

优势

缺点

BS-seq

转化效率高,可达到99%以上

模板损伤大;高投入量、低有效数据量;覆盖率低;碱基不平衡

EM-seq

模板损伤少;覆盖率高

转化率低;碱基不平衡

TAPS

模板损伤少;正向转化,碱基平衡

脱氨基过程中产生的DHU碱基在PCR扩增过程中可能会产生一定的偏好

 

传统的BS-seq被认为是甲基化分析的金标准,但存在明显的限制:对DNA损伤大,影响模板利用率;非甲基化C转化为T,基因组碱基不平衡;难以区分5mC和5hmC(另一种重要的甲基化类型,区分5mC和5hmC水平具有重要的临床意义)。最近开发的酶学检测技术解决了DNA损伤的问题,但还存在一定局限性,如DNA样本需求量大、不能区分5mC和5hmC等。

 

为解决上述检测问题,美国宾夕法尼亚大学研究团队在Nature Chemical Biology上发表了题为“Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution”的文章。其开发了一种DNA甲基化测序新方法:直接甲基化测序(DM-Seq)。DM-Seq可保持基因组碱基平衡:转化过程中,非甲基化C与5hmC不变,5mC转化为T;完全使用酶法处理:灵敏度高,不损害样本;少量DNA样本就可以在单碱基分辨率下对5mC进行分析,有望应用于液体活检和早期癌症检测等

 

DM-seq流程解析:

 

① 末修加A:待测模板片段化及末修加A;

 

② 接头连接:DNA片段与耐受胞嘧啶脱氨酶(APOBEC3A)脱氨基作用的接头(含5pyC)连接。常规甲基化接头含有5mC,很容易通过酶脱胺转化为T,因此需要对接头进行修饰(5pyC接头),防止被A3A脱氨;

 

③ 合成互补链:使用Bst DNA Polymerase合成有利于DNA羧甲基转移酶(CxMTase)活性的半甲基化互补链。半甲基化CpG的存在可提高DNA的羧甲基化效率;

 

④ 羧甲基化:CxMTase以CxSAM为底物产生5-羧甲基胞嘧啶(5cxmC)保护所有未修饰的C;

 

⑤ 葡糖基化:β-葡糖基转移酶的葡糖基化作用将5hmC变为5ghmC,保护所有5-羟甲基胞嘧啶(5hmC);

 

⑥⑦单链去除:绿豆核酸酶降解未复制的链(特异性降解单链);

 

⑧ 脱氨:A3A脱氨酶仅作用于未受保护的5mC,产生T;

 

⑨ 测序:5mC测序结果显示为T。

想要直接检测5mC需要满足两个要求:保护基团有效转移至未修饰的CpG;保护新生成的修饰碱基免受A3A介导的脱氨作用。CxMTase以carboxy-S-adenosyl-l-methionine(CxSAM)为底物生成的5cxmC可以抵抗酶促脱氨。使非甲基化C在转化的过程保持为C,最终实现5mC的直接测序。

 

DM-Seq对5mC的直接检测能够更好地推动表观遗传测序在癌症治疗中的应用,但其中核心酶原料CxMTase无商业化产品,限制了其进一步的发展应用。翌圣紧跟科研前沿,借助翌圣镁孚泰生物ZymeEditor点击了解更多酶改造及发酵、纯化工艺平台成为首家DNA羧甲基转移酶(CxMTase,14555ES商业化产品供应商,并可提供DM-seq全套酶原料,助力新技术研发及转化。

 

翌圣CxMTase性能展示

 

低投入量即可高效完成DNA甲基化:

使用CxMTase对含有HpaII酶切位点的DNA模板进行甲基化修饰,该酶切位点受CpG甲基化影响,未修饰模板被切割,甲基化模板不切割;

酶切结果表明在CxMTase投入量为0.31 pmol时,模板DNA未发生切割,酶切完全阻断,表明模板已被完全甲基化修饰。

 

 

 

DM-seq相关产品推荐

 

产品定位

产品名称

产品货号

末修加A

T4 DNA Polymerase

12901ES

T4 Polynucleotide kinase

12902ES

接头连接

Hieff® Quick T4 DNA Ligase

10301ES

互补链扩增

Hieff® Bst Plus DNA Polymerase

14402ES

葡糖基化

T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT)

14551ES

羧甲基化

CpG-Specific Carboxymethyltransferase

14555ES

脱氨

Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein

14553ES

参考文献:

[1] Wang, T., Fowler, J.M., Liu, L.et al. Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution. Nat Chem Biol (2023). https://doi.org/10.1038/s41589-023-01318-1

 

 

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