要想成为流式细胞术大神

既要了解流式细胞术的原理

又要懂得荧光素的选择

最重要的是

读 懂 流 式 图！

流式图有单参数直方图、二维散点图、二维等高线图与密度图，三维图以及假三维图，其中最常用的是二维散点图和单参数直方图。本文主要对二维散点图、单参数直方图及一些常见问题进行介绍。


1.二维散点图

二维散点图能够表示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。散点图是一种双变量描述，可被分为四象限，至少产生四种可能的结果来明确区分阴性和阳性。其结果用整个散点图中出现的特定象限的细胞占全部细胞的百分率表示，每个点表示一个单独事件。这四个象限分别用LL，UL，UR，LR表示。

图1：CD4/FITC(BF00201)、CD8/APC-Cy7（BF00321）双染

看图技巧：
LL（左下）：表示对于X轴所代表的参数呈阴性，对于Y轴所代表的参数呈阴性反应的细胞，如图表示CD8、CD4双阴性细胞。
UL（左上）：表示对于Y轴所代表的的参数呈阳性，对于X轴所代表的参数呈阴性反应的细胞，如图表示CD8+、CD4-细胞。
UR（右上）：表示对于X轴、Y轴所代表的参数呈双阳性的细胞，如图表示CD8+、CD4+双阳性细胞。
LR（右下）：表示对于X轴所代表的参数呈阳性反应，而对Y轴所代表的参数呈阴性反应的细胞，如图表示CD8-、CD4+细胞。
大神支招：必须先了解X轴、Y轴各自所代表参数的意义；再看四个象限，并了解各象限意义；数据统计时，检测目的物一般用各象限区内的细胞数占门内细胞数百分比或平均荧光强度表示 。

2.单参数直方图

单参数直方图是一维数据用的最多的图形显示形式，即可用于定性分析，又可用于定量分析。每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）。利用直方图来设门分析，可得到细胞数目（events）、门内细胞百分比（%gated）、平均荧光强度（mean）、中位数（median）等统计参量，总的来说单参数直方图只能表示具有同一特征细胞的数量及其荧光强度。

图2：左为细胞周期（BA00205）分析；右为CD4/FITC(BF00201)表达情况

看图技巧：先看横纵坐标了解检测目的，纵坐标代表细胞数(如图细胞周期分析（BA00205）；G1表示细胞进行大量遗传物质合成的时期，G2表示DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙，图右为CD4/FITC(BF00201)的蛋白表达情况)；看图形分布，直方图峰型越往右移，代表其荧光强度越强。（右图中M2区域细胞的荧光强度要高于M1区域细胞的荧光强度）；M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光阈值设定的，峰型右移荧光信号大于基础荧光阈值M1，表示阳性M2。

Q&A

Q1:流式图中的颜色与荧光颜色是否一致?
A：与荧光颜色无关，流式图中的颜色为人为指定。
Q2：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分?
A：实际上这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的，即使用同型抗体进行平行实验，反映待测标本对抗体非特异性结合的水平，以帮助省去繁琐的竞争封闭步骤。右图即阳性组，也就是接受刺激后的蛋白表达情况。
Q3: 这么巧，阴性正好在10¹划分？
A：其实我们可以人为地将电压、放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在10¹附近）这样后期做sample时好看，当然也可以调到10²，10³次方。
Q4：为什么要进行荧光补偿？
A：流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

Bioss 流式细胞技术服务

本服务项目是利用流式细胞仪和荧光标记抗体对客户提供的细胞样品或全血样品进行检测分析。
可检测项目：
1、细胞周期检测：包括细胞培养，细胞周期同步化，细胞进行加药处理，细胞收集乙醇固定，PI染色上机样本制备，流式上机检测，数据分析。
2、细胞凋亡检测：包括细胞培养，细胞进行加药诱导处理，细胞收集样本制备，流式上机检测，数据分析。
3、免疫细胞分型：包括细胞收集样本制备，流式上机检测，数据分析。
4、细胞表面抗原鉴定：包括细胞收集样本制备，流式上机检测，数据分析。
5、同城上机检测：由客户制备好样本，流式上机检测，数据分析。

八色小鼠脾脏免疫表型分析

1）在FSC/SSC图上，设门P1圈出淋巴细胞；基于淋巴细胞在FSC-H/FSC-A图上设门E2圈出单个细胞排除粘连体；基于E2在7-AAD/SSC图上设门R3圈出7-AAD阴性的活细胞。
2）基于R3门，在CD3/CD19图上设十字门，CD3+CD19-为T细胞，CD3-CD19+为B细胞。
3）基于R3门，在CD3/NK1.1图上设十字门，CD3-NK1.1+为NK细胞，CD3+NK1.1+为NKT细胞。
4）基于CD3+T细胞，在CD4/CD8a上设十字门，CD4+CD8-为辅助性T细胞，CD4-CD8+为细胞毒性T细胞。
5）基于CD3+T细胞，在CD8a/CD103和CD25/CD4图上分析CD103、CD25的表达情况。

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图3：八色小鼠脾脏免疫表型分析

经典双激光六色荧光搭配方案